融合抗菌肽实验研究及猪场疫病防控实际应用效果
一、猪场疫病现状及发展态势
自从HPRRS出现后,HPS,SS,PRDC等疫病时常以混合感染的形式出现,PCV2及PCVAD近年来在全国蔓延,FMD大范围的频繁出现,呈现出高发病率,PED在全国肆虐,造成了极高的死亡率,ERY卷土重来,PR又掀风波。
当今猪场主要疫病及混合感染情况——通过对7972例保育猪病料病原混合感染检测结果统计(吴斌2012)混合感染模式共达263种。其中最常见的9种混感模式例举如下:
当前形势严峻,前景堪忧,除与猪群生存环境恶化,霉菌毒素等有关外,还与PRRS、PCV2免疫抑制病有关。防控新思路:加强饲养管理,严格生物安全措施,减少滥用药物及免疫,增强猪群抵抗力。
二、猪场常规免疫宏观效果评价
1.HCLV,PR,PPV,JEV,MP等均被认同
2.PCV2苗近年为国内外学者认同
3.FMD与毒株、剂量、免疫次数等密切相关
4.PRRS MLV争议较大,主要疫争议点:
PRRS免疫机制未明确
PRRSV特性:ADE,持续感染,机体难发现,免疫反应后延等
当前滥用、错用、大量免疫、频繁免疫、强制免疫都是不科学的
PRRS MLV实际免疫应关注点未能明确指出
现在猪场生产中迫切需求减少猪场及猪群体内PRRSV 病毒载量的有效制剂。
三、抗菌肽(AMPs)及其生物学特性
抗菌肽是一类具有抗菌活性的阳离子短链多肽的总称,也是先天免疫系统的组成部分,具有生物效应靶向性,对多种病原体(细菌、病毒、真菌、寄生虫)和癌细胞具有杀伤或抑制作用,而对真核细胞不具细胞毒作用。抗菌肽生物活性稳定:在高离子强度和酸碱环境中或100℃加热10分钟时仍具有杀/抑菌作用,同时具有协同抗菌效应:能与宿主体内某些阳离子蛋白、溶菌酶或抗生素协同作用,增强其抗菌效应;具有与抗生素不同的杀菌机制,不易产生抗菌肽耐药菌株;能与细胞脂多糖(LPS)结合,中和内毒素,防治革兰氏阴性菌败血症和内毒素中毒性休克;具有免疫调节作用,可招募并增强吞噬细胞的杀菌作用,而降低由前炎症细胞因子引发的炎症反应。
四、融合抗菌肽(金源肽)构建和表达研究主要内容
1.筛选、组合抗菌效应互补的抗菌肽——MAPWA 及PGBD-2(国家发明专利号201110068695.3),形成融合抗菌肽
2.融合抗菌肽MAPWA(蛙皮素-美洲商陆素抗菌肽)
3.融合抗菌肽PGBD-2(猪PG-1与防御素PBD-2抗菌肽)
4.融合抗菌肽高效表达质粒及转化研究
5.融合抗菌肽基因真核高效表达研究
五、融合抗菌肽体外对猪免疫调节和抑制病毒复制的研究
用P1和P2(MAPWA和PGBD-2)与猪免疫细胞在体外培养,MTT法观察它们对免疫细胞的刺激增殖活性;同时加入PRRSV共培养,以定量实时RT-PCR技术检测免疫细胞和Marc-145细胞及培养液中的PRRSV病毒含量。结果发现:P1和P2融合抗菌肽具有显著的免疫激活特性,P2的免疫刺激作用较强;同时P1和P2融合抗菌肽能够显著减少PRRSV在免疫细胞和Marc-145细胞的复制量;证明融合抗菌肽PGBD-2和MAPWA具有显著的免疫增强效应,并且能显著地抑制病毒复制,减少其在靶细胞中的含量。提示融合抗菌肽分子具有免疫强化作用和抑制PRRSV在靶细胞复制的效应。
图1 P1和P2融合抗菌肽对猪免疫细胞的刺激效应
图2 不同处理免疫细胞中PRRSV含量随培养时间的变化结果
图3 P1和P2处理对PRRSV在Marck 145 细胞中复制的影响
六、融合抗菌肽产品对猪体内PRRSV及PCV2带毒率影响的初步观察
母猪日粮从配种后1月龄至哺乳结束全程添加2‰金源肽Z30。其后代仔猪日粮中在教槽料和保育料中分别按8‰、2‰添加金源肽Z10直至保育结束。结果发现:金源肽饲料饲喂的后备母猪体内血液免疫细胞的IL-10基因表达量较对照后备母猪显著下降,而其CD4基因表达水平显著增高;实验组后备母猪的PRRSV和PCV2带毒率率明显减少,病毒含量也显著降低;实验母猪和仔猪的特异性猪瘟抗体含量明显高于对照猪。这些表明:金源肽产品添加入饲料可显著增强动物的免疫调节水平,提高抗PRRSV和PCV2感染的能力,有助于控制、减少病毒在体内的复制;对仔猪和后备母猪的健康和生长发育均有良好的促进作用。
图4 金源肽饲喂后备母猪血液PRRSV含量的变化
图5 实验猪血液PCV2的含量变化
图6 实验猪血液免疫细胞IL-10基因表达量的变化
图7 实验猪血液免疫细胞CD4基因表达量的变化
七、融合抗菌肽产品在国家级松桠原种猪场实际应用试验结果
在四川铁骑力士绵阳松桠原种猪场进行了较为全面的试用验证。该场是我国首批通过国家认证的18个国家级核心原种猪场之一。母猪配种后1月饲喂2‰含量的金源肽,能改善母猪繁殖性能,窝产子数较对照组提高0.92头。保育期仔猪饲喂8‰、2‰含量的金源肽,到保育期63天结束时,实验组仔猪较对照组平均每头多增重3.66公斤,显示了极为明显的生长发育促进效应。
金源肽产品优良的保健性能主要体现在以下几个方面:
1.改善母猪的繁殖性能,降低母猪死胎率,增加活产健仔数;提高哺乳母猪泌乳量,改善奶水品质;提高配种率,降低怀孕母猪返情率。
2.提高仔猪健康水平,促进生长,减少仔猪疾病发生,降低死亡率,改善弱仔。
3.辅助治疗作用,金源肽产品在实际应用过程中,还体现出来较好的辅助治疗效果和药物疫苗协同增效作用。对圆环病引起的肾炎皮炎综合症的辅助治疗,对蓝耳病的缓解作用。